Real-time fluorescence quantitative PCR ke mokhoa oa ho metha kakaretso ea sehlahisoa ka mor'a potoloho e 'ngoe le e' ngoe ea polymerase chain reaction (PCR) ho DNA amplification reaction ho sebelisa fluorophore.Mokhoa ona o sebelisetsoa ho lekanya tatellano e khethehileng ea DNA sampoleng e lokelang ho lekoa ka mekhoa ea litšupiso ea kahare kapa kantle.Ho tloha ha e qala, liteko tsa fluorescent quantitative PCR li atile haholo ho matichere a laboratori.
Fluorescence PCR molao-motheo: Fluorescence PCR, ea pele e bitsoang TaqManPCR 'me hamorao ea boela ea e-ba Real-TimePCR, ke mokhoa o mocha oa ho lekanya nucleic acid o entsoeng ke PE (PerkinElmer) USA ka 1995. Mokhoa ona o itšetlehile ka tlatsetso ea probe e ngotsoeng ka fluorescent kapa e tsamaisanang le eona. dae ea fluorescent ho PCR e tloaelehileng ho fihlela tšebetso ea eona ea bongata.Molao-motheo: ha karabelo ea PCR e ntse e tsoela pele, lihlahisoa tsa karabelo ea PCR lia bokellana 'me matla a lets'oao la fluorescent a eketseha ka tekanyo e lekanang.Ka potoloho e 'ngoe le e' ngoe, lets'oao la matla a fluorescence le bokelloa e le hore re ka hlokomela phetoho ea palo ea sehlahisoa ka phetoho ea matla a fluorescence mme kahoo re fumane graph ea fluorescence amplification curve.
Ka kakaretso, sekhahla sa amplification sa fluorescence se ka aroloa ka mekhahlelo e meraro: mokhahlelo oa lets'oao la mokokotlo oa fluorescence, mohato oa phallo ea mats'oao a fluorescence le karolo ea sehlaba.Nakong ea mokhahlelo oa lets'oao la bokamorao, lets'oao le matlafalitsoeng la fluorescence le koaheloa ke lets'oao la bokamorao ba fluorescence mme liphetoho tsa palo ea sehlahisoa ha li tsejoe.Karolong ea sehlaba, sehlahisoa sa amplification ha se sa eketseha ka sekhahla, ha ho na kamano e haufi pakeng tsa palo ea sehlahisoa sa ho qetela le chelete ea template ea ho qala, 'me nomoro ea kopi ea DNA e qalang e ke ke ea baloa ho latela palo ea ho qetela ea sehlahisoa sa PCR.Ke feela mokhahlelong oa ho hōlisa ka matla oa lets'oao la fluorescent moo ho nang le kamano pakeng tsa logarithm ea palo ea sehlahisoa sa PCR le palo ea template ea ho qala, 'me re ka khetha ho lekanya sena mothating ona.Bakeng sa boiketlo ba quantification le papiso, likhopolo tse peli tsa bohlokoa haholo li kentsoe mokhoa oa 'nete oa nako ea fluorescent quantitative PCR: moeli oa fluorescence le boleng ba CT.
Monyako ke boleng bo behiloeng ka maiketsetso holim'a curve ea amplification ea fluorescence.karolo ea exponential ea PCR amplification.
Ct value: ke palo ea lipotoloho tseo lets'oao la fluorescence ka har'a tube e 'ngoe le e' ngoe ea karabelo e bileng teng ho fihlela boleng ba domain name.
Kamano pakeng tsa boleng ba Ct le template ea ho qala: liphuputso li bontšitse hore boleng ba Ct ba template ka 'ngoe bo na le kamano e lekanang le logarithm ea nomoro ea kopi e qalang ea thempleite eo, likopi tse ngata tsa nomoro ea kopi e qalang, Ct e nyenyane haholo. boleng.Litekanyetso tsa Ct li batla li tsitsitse.Mokokotlo o tloaelehileng o ka etsoa ka mokhoa o tloaelehileng o nang le nomoro ea kopi ea ho qala e tsejoang, moo khokahanyo e otlolohileng e emela logarithm ea nomoro ea kopi e qalang 'me khokahanyo e otlolohileng e emela boleng ba Ct joalokaha ho bontšitsoe setšoantšong se ka tlase.
Ka hona, ka ho fumana boleng ba Ct ba sampuli e sa tsejoeng, nomoro ea kopi e qalang ea sampuli eo e ka baloa ho tloha mokhoeng o tloaelehileng.
Boleng ba Ct ha bo fetohe 'me bo ka susumetsoa ke mehlala e fapaneng le lisebelisoa tse fapaneng, esita le haeba sampuli e tšoanang e phetoa ka makhetlo a 2 ka sesebelisoa se le seng, boleng ba Ct bo ka fapana.
Litlhahlobo tse ngata tsa fluorescence: Litlhahlobo tse ngata tsa fluorescence li ka aroloa ka li-fluorescent probes le lidae tsa fluorescent ho latela matšoao a sebelisitsoeng.Lisebelisoa tsa fluorescent li kenyelletsa theknoloji ea Beacon (theknoloji ea li-molecular beacon, e emetsoeng ke American Tagyi), TaqMan probes (e emetsoeng ke ABI) le theknoloji ea FRET (e emetsoeng ke Roche);lidae tsa fluorescent li kenyelletsa li-dyes tse nang le fluorescent tse tletseng le li-fluorescent tse sa tsitsang, moemeli ea tloaelehileng oa lidae tsa fluorescent tse sa tsoetsoeng ke SYBRGreen I, e sebelisoang hangata hona joale;saturated Moemeli ea tloaelehileng oa li-saturated fluorescent dyes ke SYBRGreenⅠ;lidae tsa fluorescent tse tletseng ke EvaGreen, LCGreen, joalo-joalo.
SYBRGreenI ke dae e tlamang ea DNA e atisang ho sebelisoa bakeng sa PCR ea fluorescent, e kopanyang DNA e marako a mabeli ka ho khetheha.Boemong ba eona bo lokolohileng, SYBRGreenI e hlahisa fluorescence e fokolang, empa hang ha e tlameletsoe ho DNA e nang le likarolo tse peli, fluorescence ea eona e eketseha ka makhetlo a 1000.Ka hona, lets'oao le felletseng la fluorescence le hlahisoang ke karabelo le lekana le palo ea DNA e nang le likhoele tse peli 'me le eketseha ha sehlahisoa sa amplification se ntse se eketseha.
Melemo ea lidae tse tlamang tsa DNA tse habeli: moralo o bonolo oa liteko, ke li-primers tse 2 feela tse hlokahalang, ha ho na tlhoko ea ho qapa li-probes, ha ho na tlhoko ea ho rala li-probes tse ngata bakeng sa tlhahlobo e potlakileng ea liphatsa tsa lefutso tse ngata, bokhoni ba ho etsa tlhahlobo ea curve point, leka ho nepahala karabelo ea amplification, litšenyehelo tse tlase tsa pele, kakaretso e ntle, ka hona e sebelisoa haholo lipatlisisong tsa lapeng le kantle ho naha.
Mokhoa oa ho hlahloba ka fluorescent (mokhoa oa Taqman): Ha ho holisoa ha PCR ho etsoa, li-primers li eketsoa hammoho le probe e khethehileng ea fluorescent.Ha probe e tsitsitse, letšoao la fluorescence le hlahisoang ke sehlopha sa moqolotsi oa litaba le kenngoa ke sehlopha se tingoeng 'me ha se lemohuoe ke sesebelisoa sa PCR;nakong ea ntlafatso ea PCR (karolong ea katoloso), ts'ebetso ea 5'-3' ea ho qhekella ea enzyme ea Taq e theola probe ka mokhoa oa enzymatic, ho etsa sehlopha sa motlalehi oa fluorescence le ho tima sehlopha sa fluorescence.
Lisebelisoa tsa fluorescent quantitative PCR.
Patlisiso ea baeloji ea limolek'hule:
1. Tlhahlobo ea nucleic acid e ngata.Tlhahlobo ea palo le boleng ba mafu a tšoaetsanoang, ho lemoha likokoana-hloko tsa pathogenic kapa likokoana-hloko, joalo ka seoa sa morao-rao sa ntaramane A (H1N1), ho lemoha lipalo tsa liphatsa tsa lefutso tsa limela le liphoofolo tse sa tloaelehang, ho lemoha litekanyetso tsa ho thibela liphatsa tsa lefutso tsa RNAi, joalo-joalo.
2. Tlhahlobo e fapaneng ea liphatsa tsa lefutso.Papiso ea phapang ea liphatsa tsa lefutso lipakeng tsa lisampole tse phekoloang (mohlala, kalafo ea lithethefatsi, kalafo ea 'mele, kalafo ea lik'hemik'hale, joalo-joalo), phapang ea polelo ea liphatsa tsa lefutso ka mekhahlelo e fapaneng le netefatso ea cDNA microarray kapa sephetho sa polelo e fapaneng.
3. Ho lemoha ha SNP.Ho lemoha ha nucleotide polymorphisms e le 'ngoe ke habohlokoa bakeng sa thuto ea ho ba le ts'oaetso ea motho ka mong ho mafu a fapaneng kapa karabelo ea motho ka mong ho lithethefatsi tse itseng,' me ka lebaka la sebopeho se bohlale sa li-beacon tsa molek'hule, hang ha tlhahisoleseding ea tatellano ea SNP e tsejoa, e bonolo ebile e nepahetse ho. sebelisa mokhoa ona bakeng sa ho lemoha SNP e phahameng.
4. Ho lemoha methylation.Methylation e amahanngoa le maloetse a mangata a batho, haholo-holo kankere, 'me Laird o tlalehile mokhoa o bitsoang Methylight, o tšoarang DNA pele ho matlafatsoa e le hore cytosine e se nang methylated e fetohe uracil le methylated cytosine e sa ameheng, ho sebelisa li-primers tse khethehileng le lipatlisiso tsa Taqman ho khetholla pakeng tsa DNA ea methylated le e se nang methylated. .kutlo haholo.
Lipatlisiso tsa bongaka:
1. Tlhahlobo ea bakhachane: batho ba ke ke ba phekola maloetse a lefutso a bakoang ke liphatsa tsa lefutso tse fetotsoeng, 'me ho fihlela joale, ba ka fokotsa palo ea masea a kulang a hlahang ka tlhokomelo ea bakhachane ho thibela ho hlaha ha mafu a sa tšoaneng a lefutso.Ena ke mokhoa o sa tsitsang o amoheloang habonolo ke bakhachane.
2. Ho lemoha likokoana-hloko: The fluorescent quantitative PCR assay e lumella boikemisetso ba bongata ba likokoana-hloko tse kang gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, kokoana-hloko ea papilloma ea motho, kokoana-hloko ea herpes simplex, kokoana-hloko ea immunodeficiency, kokoana-hloko ea hepatitis, kokoana-hloko ea ntaramane, Mycocycyculosis megavirus tuber EB.E na le melemo ea kutlo e phahameng, boholo ba sampole e tlase, lebelo le bonolo ha li bapisoa le mekhoa ea khale ea tlhahlobo.
3. Tlhahlobo ea katleho ea lithethefatsi: tlhahlobo ea palo ea kokoana-hloko ea lefu la sebete la mofuta oa B (HBV) le kokoana-hloko ea hepatitis C (HCV) e bontša hore kamano pakeng tsa bongata ba kokoana-hloko le katleho ea lithethefatsi tse itseng.Haeba boemo ba serum ea HBV-DNA bo fokotseha nakong ea phekolo ea lamivudine ebe bo eketseha hape kapa bo feta tekanyo e fetileng, sena se bontša phetoho ea kokoana-hloko.
4. Tlhahlobo ea oncogenetic: Le hoja mokhoa oa ho hlahisa hlahala o e-s'o hlake, ho amoheloa hohle hore liphetoho tsa liphatsa tsa lefutso tse amehang ke sesosa se ka sehloohong sa phetoho ea oncogenic.Ho eketseha ha polelo le phetoho ea li-oncogenes li ka bonoa methating ea pele ea lihlahala tse ngata.PCR ea nako ea 'nete ea fluorescence quantitative ha e sebetse feela ho lemoha liphetoho tsa liphatsa tsa lefutso, empa e ka boela ea lemoha ka nepo polelo ea li-oncogenes.Mokhoa ona o 'nile oa sebelisoa ho lemoha ponahalo ea mefuta e fapaneng ea liphatsa tsa lefutso tse kenyeletsang mofuta oa telomerase hTERT, mofuta o sa foleng oa granulocytic leukemia WT1, mofuta oa oncogenic ER, mofuta oa PSM oa kankere ea senya, le liphatsa tsa lefutso tse amanang le hlahala.
E fetoletsoe ka www.DeepL.com/Translator (mofuta oa mahala)
Nako ea poso: Jun-21-2022